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以下文章来源于德安实验诊断 ，作者郭小兵
PCR技术一经问世，就被迅速而广泛地应用于分子生物学的各个领域。因具有高度特异性、灵敏度，故PCR技术在临床疾病诊断及病院微生物鉴定中，成为极为重要的实验手段。在新冠肺炎疫情防控中，PCR检测技术更是具有不可替代的实验诊断价值。PCR反应体系涉及靶标、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶以及Mg2+等多个要素。近期，因为北京地区发现新冠核酸检测单基因阳性，“靶标”概念一度成为大家讨论的热点。
靶标，就是扩增模板，或者说是目的基因，即我们检测病原体时，扩增的基因片段。从新冠核酸检测来说，我们检测的靶标多为新型冠状病毒基因组中N基因和ORF1ab基因。
作为靶标，其主要的特征就是特异性，或者说高度保守性。通俗地讲，就是靶标基因片段是病原菌所独有的。特异性的高低，直接决定着PCR检测的精准程度。特异性越高，准确度越高。在病原体检验实践中，目的基因均是高度保守位点，故靶标的特异性均可保证，结果准确性也会有保障。对于新冠核酸检测靶标而言，ORF1ab基因最为保守，故其PCR扩增检测的特异性要优于N基因。
实时荧光定量 PCR，通过实时检测每次循环产物的荧光信号（扩增产物量），实现对靶标（目的基因）的定量分析，因此靶标原始量直接着影响检测结果。一般而言，靶标原始量对于精准检验影响可归结为两点。载量过高且超出了所用方法的检测线性范围时，检测结果会欠精准，不利于治疗监测。故部分PCR检测方法在病原体载量过高时，系统会提示工作人员稀释标本后再行检测；载量过低且低于或接近所用方法的最小检测限度，即灵敏度时，会出现假阴性结果。
总体来看，靶标原始量涉及标本中病原体量及病原体自身靶标拷贝数。
1.标本中病原体量 是指标本中所含病原体的数量。病原体量越大，靶标的载量越高。2.病原体自身靶标拷贝数 是指靶标在病原体内的拷贝数。不同的基因靶标在病原体内拷贝数存在差异。 以新冠核酸检测为例，若患者处于活动期，尤其是德尔塔毒株感染时，标本中病毒/靶标载量会较高，实验室检验结果准确性有保证；若患者处于感染初期，或者是无症状感染者、治疗恢复期患者等时，标本中的病毒/靶标载量会很低，此时会有假阴性的结果出现。需要我们关注的一点是，新型冠状病毒核酸序列中，ORF1ab 基因只存在于完整的病毒基因组中，N 基因可同时存在于全长基因组和其他亚基因组 RNA中，而病毒体内亚基因组有一定的丰度，故同时作为PCR扩增靶标，N 基因原始拷贝数显著多于 ORF1ab基因。基于此，对感染初期、无症状感染者、治疗恢复期等病毒载量较低患者检测时，有时会出现N基因单基因阳性的现象。此点从病毒感染状态及病毒体内靶标拷贝数差异方面诠释了实验室检测单基因阳性的原因，也是对方法学上解释单基因阳性的有效补充。从技术原理上来看，与单一拷贝靶标相比，选择病原体内拷贝数较高的基因片段作为靶标，相当于提高了PCR检测的灵敏度，检测结果更为准确。
1.若方法本身可有效克服扩增反应间的干扰，则尽量选择双和或多靶标PCR技术。4.关注靶标基因序列变异，若突变涉及扩增起始位点，则需重新选择靶标。
1. 丁香园，新冠病毒基因组特性分析与检测试剂性能的关联性
来源：德安实验诊断
