本文转载自 戴菁 王学锋 定向点金 金宝

血友病是常见的遗传性出血性疾病，分为A（HA）和B（HB）两型，其发病原因是凝血因子Ⅷ基因（F8）或Ⅸ基因（F9）缺陷导致蛋白的合成缺陷或质的异常，或者两者兼有之。近年来，随着实验室筛选实验和检测方法的不断改进，对轻型血友病患者的诊断率提高，发病率有所上升。

F8基因位于Xq28，全长186Kb，由26个外显子和25个内含子组成，FⅧmRNA全长约9Kb，编码了由2351个氨基酸残基（AA）组成的多肽链，FⅧ蛋白分泌入血后，在血液中与血管性血友病因子（vWF）结合，以FⅧ/vWF复合物形式存在，后者可稳定FⅧ，防止其过早降解。F8基因不仅结构庞大，而且导致HA的基因突变种类繁多，其中基因内含子22倒位突变引起的FⅧ蛋白缺乏，占重型血友病A分子发病机制的42%；而内含子1倒位的发生率大约占重型血友病A的2~5%，其余几乎每个家系都有不同的突变。目前，F8基因突变数据库报道的有2015种各种不同的突变，包括点突变、基因缺失、插入、无义突变、剪接突变等，从而提示F8基因异常具有高度的异质性；中型和轻型血友病中，86%为错义突变。

通过基因诊断可以更精准地为血友病患者及其家属开展优生优育指导，尤其是对家族中有生育希望及可能的女性进行携带者基因检测，对优生优育有重要的价值。同时，对血友病患者进行明确的基因诊断有利于接受预防治疗的患者更明确地知晓导致疾病的基因类型

1. 血友病A基因诊断常规流程：

（1）内含子倒位的检测：内含子22倒位是20%HA患者的致病突变，是45%重型HA患者的致病突变。内含子22倒位是F8基因第22内含子内的Int22h序列与基因外的两个与之高度同源的序列（Int22h-2，Int2h-3）之一发生染色体内的同源重组，导致FⅧ基因在外显子1~22 与23~26间发生断裂，不能合成正常的凝血因子FⅧ，导致重型血友病A。内含子1倒位是继内含子22倒位后被发现的另一导致血友病A的重要发病机制，系内含子1内的Inth-1与基因外的高度同源的序列Inth-2发生染色体内的同源重组，导致FⅧ蛋白不能正常合成。因此，首先需要对HA患者的F8基因内含子22倒位和内含子1倒位进行检测。

（2）F8基因26个外显子及其侧翼序列的基因检测：分别针对F8基因的共26个外显子以及5’端和3’端非编码区设计特异性引物，运用PCR的方法将上述目的片段进行扩增，随后采用Sanger法进行基因序列的检测。使用该方法可以检测出绝大部分的F8基因突变位点，包括小片段的缺失、插入、点突变（无义突变和错义突变）、剪切位点突变等。

（3）间接基因诊断：对于HA，由于F8基因不仅庞大且结构复杂，直接查找突变费时费力，故可以采用结合遗传连锁分析的间接诊断方法进行血友病A的携带者与产前诊断。

2. 血友病B基因诊断流程：由于FⅨ基因较小，可以采用直接的核酸测序方法进行基因突变检测；F9基因外的6个多态性位点经过多重PCR扩增可用于血友病B的遗传连锁分析，但也无法排除基因重组的发生对其结果的干扰。

3. 特殊血友病患者的基因检测方法：

（1）拷贝数检测：运用上述基因诊断策略基本能对90%以上的HA患者做出明确的基因诊断，但仍有10%左右的患者未能找到明确的突变位点，需要用其他的技术进行诊断

（2）NGS检测：NGS又称为二代测序[29]，这是相对于Sanger一代测序而言，是近几年发展起来的一种高效率的基因测序方法，其检测深度和广度、高通量等特性使得其在临床上得到了广泛应用

（3）女性HA的基因诊断：女性HA十分罕见，首先需要注意和血管性血友病（VWD）在表型上进行鉴别；在对F8基因进行检测后，若能发现基因缺陷，则对确立女性血友病的诊断具有重要价值

（4）散发家系：根据文献报道，大约1/3的血友病A家系为没有家族史的散发家系，对于这些家系，目前主要通过直接诊断和间接诊断相结合的策略。

2. 患者家族对基因诊断的认识：目前所有的检测技术由于各种原因限制以及基因突变复杂性、异质性等特点的影响，均无法达到100%的检测准确率，随着检测技术的不断发展，即使是最新的NGS技术用于血友病的基因检测，仍有患者无法得到明确的基因结果，利用最新的NGS技术结合MIP分子检测策略，HA和HB的可诊断率分别达到了98.1%和99.3%，但仍然有血友病患者在所有能使用的基因检测方法后仍无法明确基因异常位点。