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PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”


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PCR的全称是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),在生物实验中十分常用,从顶尖实验室到大学课堂,从国际空间站到医院检验科,基本都能看到PCR的影子,几乎成了生物学、医学研究中最必不可少的工具。



PCR循环主要分3步:

变性,退火,延伸


  • 变性:

用高温(94-96℃)让DNA双螺旋结构变性,使两条互补链分开变成单链;


  • 退火:

降低温度(50-65℃),让引物与单链DNA结合,形成局部双链;


  • 延伸:

DNA聚合酶(Taq酶,最佳活性温度约为75-80℃)跟在引物后面,给单链DNA合成另一条互补的链,DNA复制就完成了) 

PCR的发明趣史早已广为流传:1972年凯利·穆利斯(Kary Mullis)在加州大学伯克利分校获得有机合成专业博士学位,1979年,进入Cetus生物公司任职,负责合成供实验室用的寡核苷酸(短链的DNA分子)。



1983年一个春天的晚上,穆利斯与当时同在Cetus工作的女友驱车前往乡间别墅度假。汽车疾驰在加州128号公路上,蜿蜒盘旋的道路渐渐在他眼前幻化成DNA双链,不断离合、延伸……此时一个惊天念头在他脑中闪现——扩增DNA片段时,如果同时添加两条引物分别扩增,是不是只要引物足够,就可以无限扩增下去?


激动万分的穆利斯当即停车,从手套箱里取出笔和纸飞快地演算起来:DNA复制1次能变成2个,复制10次大约是1000个,复制20次就有100多万个了,要是能复制30次,就有惊人10亿个,这可是人类基因组中碱基对的总量啊!



1983年8月,他首次在公司做了有关PCR原理报告,但大家反应冷淡,认为这个原理太简单了,如果可行,早就有人做了。1986年5月,穆利斯经公司主管向沃森推荐,第一次受邀在一次“人类分子生物学”专题研讨会上做了PCR原理及实验应用报告。为此,1993年缪里斯获得了诺贝尔化学奖。


PCR循环中,先用高温让DNA双螺旋结构变性,使两条互补链分开变成单链;然后降低温度,让引物与单链DNA结合;最后,DNA聚合酶跟在引物后面,给单链DNA合成另一条互补链,DNA复制就完成了。


穆利斯最初用的是大肠杆菌DNA聚合酶,这种酶不耐热,温度一高就失活,导致每个循环都重新添加,不但麻烦,而且成本非常高。穆利斯也觉得这样不行,提出要换一种耐高温DNA聚合酶,在高温状态也不会失活,这样整个PCR过程只需要加一次酶就够了。


那有没有这样的耐高温酶呢?


1969年,美国微生物学家托马斯·布洛克(Thomas D. Brock)从黄石国家公园的大棱镜温泉中分离出一种全新的嗜热菌,能在85℃以上的温泉里生存。


1973年,中国台湾女科学家钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系,她的导师对黄石公园里热泉中发现的嗜热菌十分好奇,他让钱嘉韵以该细菌作为研究主题。她从黄石公园的水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离出了Taq DNA聚合酶,并于1976年在《细菌学杂志》上以第一作者身份发表了论文。这篇论文在科学界被广泛引用。


Taq DNA聚合酶的最佳活性温度为75~80℃,即使在95℃下,半衰期依然超过40分钟。这种超级耐热的DNA聚合酶仿佛就是为PCR而生的,一次添加,全程耐用,再也不用打开管子一次次加酶了。



经过一番搜索,钱嘉韵在9年前提取出的耐高温Taq DNA聚合酶给了穆利斯灵感,在公司另一组科学家帮助下,按照钱嘉韵论文描述的方法,Taq酶于1985年秋天被成功提取出来,并被马上应用到了PCR中,该酶不但专一性和活性优于之前使用的DNA聚合酶,而且使PCR变得十分简捷,大大降低了成本,PCR实验终于可以全程闭管一站到底。Taq酶甚至在1989年赢得了《科学》杂志的“年度最佳分子”奖。其实Taq酶当时发现后好像也找不到什么实际用处,毕竟谁会在“开水”里面做实验呢。但科学发现有时候就是这样,你以为没用的发现,谁知道多年以后会被别人捡起来用在什么地方。


1989年,Science杂志隆重报道了PCR技术和耐高温DNA聚合酶,Cetus公司也和罗氏公司合作,将PCR技术用于临床诊断。如今,PCR不仅应用在分子生物学相关领域和产业,各行各业都留下了它的足迹,包括分子克隆、基因表达、转基因检测、农业与食品致病微生物检测、病原微生物检测、肿瘤诊疗、遗传病检测……这是一个改变世界的伟大技术。


可以说,将PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”,是由中国科学家钱嘉韵完成的,是她发现并分离了耐高温的DNA聚合酶。PCR从畅想到实现,也有中国科学家的一份贡献。


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