【摘要】抗苗勒氏管激素(AMH)的水平对卵巢中的卵泡发育与类固醇激素的产生具有重要意义。体循环中AMH 水平受性别和年龄等因素影响, 在性腺发育和生殖系统疾病的评价中至关重要。AMH可预测卵巢在辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology, ART)中的反应性及女性绝经时间等, 并反映卵巢手术或损伤后的卵巢储备能力。本文对近年来关于AMH评价卵巢储备及ART 中卵巢反应性的相关研究成果进行综述。
关键词: 抗苗勒氏管激素(AMH); 卵巢储备; 卵巢反应性
抗苗勒氏管激素(anti-Müllerianhormone, AMH)也被称为苗勒氏管抑制激素, 是转化生长因子b(TGF-b)家族的一种糖蛋白同型二聚体, 该基因位于19p13.3, 包含5个外显子。AMH受体是单跨膜蛋白, 具有丝/苏氨酸激酶活性, 常表达于苗勒氏管、睾丸支持和间质细胞以及卵泡细胞表面。性别尚未分化的胚胎具有Wolffian管和苗勒氏管。男性睾丸支持细胞从孕7周开始分泌AMH, 导致苗勒氏管退化, 由此Wolffian管在睾酮的作用下发育成附睾和精囊, AMH水平保持稳定直到青春期睾酮大量合成出现骤然下降。而女胎早期体内缺乏AMH导致苗勒氏管发育成子宫、双侧输卵管及部分阴道, 36周胎龄后机体内才出现AMH。女性体内AMH在出生后由颗粒细胞产生, 受性别和年龄等因素影响。AMH缺失的小鼠尽管能正常排卵, 但卵巢内有过多生长、衰老和闭锁的卵泡, AMH对窦卵泡生存的维持起重要作用, 它能预测卵巢中窦卵泡及窦前卵泡的数量。AMH在临床上应用广泛, 卵巢肿瘤、多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome, PCOS)患者体内AMH水平较高, 而绝经后及Turner综合征患者AMH接近消失。近年来随着高龄女性生育需求的增加, AMH在临床工作中越来越受到医生和患者的重视, 已经成为预测卵巢在体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer, IVF-ET)治疗中的反应性及女性绝经时间的重要指标, 并反映卵巢手术或损伤后的卵巢储备能力。
1 AMH检测方法的比较
自从1999年IOT上市第一代AMH 检测试剂盒,AMH检测方法在不断革新以提供更准确、稳定的最佳试剂种类。随着AMH相关研究不断深入, DSL等多家公司参与AMH试剂盒的研发。随后, 采用GenerationⅡELISA试剂盒手动法测量AMH(目前被自动免疫分析替代), 测量范围更广且准确度更高。其中ElecsysCobas检测法AMH最低限为0.07ng/mL,而GenⅡELISA低限为0.42ng/mL, 在Access2和DxI800分析比较发现AccessAMH检测法在批内(CV1.41%~3.30%)及批间(CV 3.04%~5.76%)精密度高。研究人员比较市面上5种检测方法最新发现, 目前多数研究采用的AMHBeckmanCoulterGenerationⅡELISA分析法对结果进行校准,准确性比DSLELISA检测法提高40%。EAIAMH采用GenⅡ和AL-105iELISA两种自动化检测产生数值稍低但结果相似, 而AccessDxi和Cobas在EIAAMHELISA平均值上有统计学差异, 分别为1.35ng/mL和1.73ng/mL。
2 AMH在评价卵巢储备中的应用
出生时原始卵泡的数量和质量决定了卵巢的储备, 这些原始卵泡发育停滞于第一次减数分裂的阶段直到青春期被募集时才开始分泌AMH。免疫组织化学结果显示, AMH在2~8mm的窦前卵泡和小窦卵泡中的表达量最高, 而发育至FSH依赖的8~10mm阶段时AMH停止分泌。青春期后AMH降低了原始卵泡对FSH的敏感性导致卵泡周期性募集愈发减少。AMH基因敲除的小鼠卵泡池中原始卵泡募集速度快、卵泡池耗竭提前, 提示了AMH可抑制原始卵泡募集发育。AMH降低卵巢黄素化颗粒细胞干细胞因子mRNA的表达, 可能与AMH调节干细胞因子, 即KIT配体(KL)和基础成纤维细胞生长因子等刺激卵泡发育的因子以抑制卵泡募集启动相关。
2.1 AMH与年龄的相关性
卵巢储备是女性生育力评估的重要指标, 卵巢储备功能低下者可募集卵泡数目少, 卵母细胞质量差, 不仅生育力下降且常常过早绝经。目前大量研究示,AMH水平随年龄的增长逐渐减少。学者们普遍认为, AMH在出生时为顶峰, 在青春期前有潜在升高, 24.5岁时达到高峰, 然后逐渐下降至绝经期。韩国一项大规模统计将月经周期正常的女性按照20~31,32~34,35~37,38~40,41~43及>43岁进行划分, 统计AMH的水平分别为4.2ng/mL,3.7ng/mL,1.50ng/mL,1.30ng/mL,0.60ng/mL, 与女性35岁后生育力明显下降相吻合, 且AMH水平随年龄增长下降的趋势提示了原始卵泡池中卵泡数目呈指数递减。目前认为AMH可以预测女性绝经年龄, 在相应年龄段AMH偏高的人绝经时间明显晚于偏低者。其相关的机制已有多项研究, 结果表明卵巢储备功能异常与AMH及AMH受体(AMHR)Ⅱ基因多态性相关, AMH对绝经时间的影响反映出AMH 对原始卵泡的募集起重要用。近年研究表明, 年轻女性卵丘细胞中AMHmRNA的表达低于年龄偏大者, 且卵泡液(follicularfluid, FF)中AMH蛋白水平在年龄偏大组明显高于年轻组, 主要由于低水平FF中AMH往往卵细胞质量好、受精率及临床妊娠率高。由此, AMH可以作为评估远期生育力的指标, 并为短期内不准备生育的女性提供卵巢储备相关可靠的评价, 帮助提示AMH低下的育龄期女性尤其是不孕患者尽早采取助孕措施。
2.2 AMH作为评价指标的可靠性
关于AMH作为评价卵巢储备指标的可靠性,部分学者认为, 不同女性体内AMH个体差异较大, 且年轻女性血清AMH的波动较年老者高, 因此AMH对卵巢储备力低下的老年女性临床意义不大,但对年轻女性卵巢储备力评估及临床疾病诊断具有重要应用价值。关于AMH浓度随自然月经周期的波动, 多数研究观察到, 血清AMH平均浓度在整个月经周期中的变化不具有统计学意义, 可以作为不受下丘脑性腺轴反馈影响的独立因素用来评价卵巢储备。部分学者进一步研究表明, 血清AMH浓度最低限不随月经周期变化, 而AMH高限水平在卵泡期的中段增加, 排卵期减少, 于黄体期中段再次上升。有研究指出, AMH与LH昼夜波动相似, 在夜间稍低, 但降低程度的差异无统计学意义。AMH水平在不同种族中也有一定差异,且抗肿瘤药物及吸烟均影响血清AMH水平。近期研究显示, 29.8%口服避孕药的女性血清AMH水平降低, 以长期用药者下降更明显, 但用药剂量与AMH下降程度无明显相关性, 且停药恢复排卵后AMH呈恢复用药前的水平趋势。而因卵巢储备功能下降导致不孕的患者, 通过性激素替代周期治疗后卵泡池内未成熟卵泡受激素刺激使AMH水平较治疗前升高, 卵巢功能得到改善, 妊娠率增加。妊娠期间卵巢处于静息状态, 卵泡的成熟明显受抑制, 加之孕期血容量增多、血液稀释导致血清AMH水平降低, 尤其是中晚孕期较为显著。已有学者测量接受ART的患者, 反复卵巢刺激后(3~6个周期)血清AMH的水平, 较ART之前无统计学差异, 说明捐卵或反复IVF周期治疗并不会造成卵巢早衰(POF)。
2.3 卵巢储备受损患者的评价
AMH对于各种相关疾病导致卵巢损伤患者卵巢储备的反映较其他评估指标更为敏感。部分学者观察到, 年轻的癌症患者接受化疗药物导致卵巢损伤后, 抑制素B(inhibinB, INHB)和雌激素无明显改变, FSH水平轻度升高而AMH水平显著下降。Turner综合征患者的卵巢储备差, 卵巢加速衰竭的风险高, 定期监测AMH水平是预测POF、及早采取治疗措施的良好指标。在多项研究中, PCOS及POF患者与健康育龄女性的AMH 水平差异性较显著, POF组血清AMH水平较正常组低2~3倍, 而PCOS组较正常组血清AMH水平高2~3倍。最新研究显示, 自身免疫性甲状腺疾病患者卵巢储备往往较正常者低, 血清AMH水平可作为独立因素预测该类患者的卵巢储备。辅助生殖技术(ART)中血清AMH水平与E2/重组FS(rFSH)比值、rFSH总剂量和MⅡ卵细胞明显相关, 自身免疫性甲状腺病不影响低AMH水平者控制性卵巢刺激(controlledovarianstimulation, COS)结局, 但高AMH水平的自身免疫性甲状腺病影响显著, 从而导致ART结局失败。
2.4 AMH与其他评价卵巢储备的因素联合应用于卵巢储备的评估
随着年龄的增长, 排卵期血清AMH、基础窦卵泡数(antralfolliclecount, AFC)、卵巢体积及抑INHB下降, 而血清FSH、LH及E2水平上升。部分专家表示, 血清AMH较性激素能更早地提示卵巢功能的衰退, 并且在评估生育年龄时, 由于AMH对于卵巢中0.4~2.0mm的早卵泡监测更加敏感, 而这些卵泡在超声下难以显示, 因此AMH结合实际年龄、性激素及AFC等因素在评价卵巢储备时更具有优势。AMH作为潜在的非生长卵泡募集标志物能更深层次地反映卵巢卵泡池的储备情况, 已有学者结合AFC及年龄等卵巢反应性预测指标(ovarianresponsepreditionindex, ORPI)以筛选出卵巢储备低下、ART预后不佳的患者, 并较为准确地预测不孕患者ART的结局。伊朗学者认为, 将AMH与FSH结合患者年龄综合考虑能更好地预测不孕患者的卵巢储备。目前多数临床工作者将血清AMH、患者年龄、INHB与AFC及基础内分泌指标等结合起来, 更加准确而综合地评估卵巢储备功能,但针对不同疾病将AMH 联合其他因素进行卵巢储备评估尚无大规模统计研究。
3 AMH 在ART中卵巢反应性的预测
ART的重要内容之一是诱导排卵(ovulationinduction, OI)和COS。OI指对排卵障碍患者应用药物或手术方法诱发排卵, COS指以药物手段在可控范围内诱发多卵泡发育和成熟。卵巢反应性的预测对ART的结局有重要意义, 国内外学者普遍认为, AMH可以帮助预测卵巢内卵泡发育情况, 并指导患者个体化制定具体治疗方案。考虑到超声难以区分对外源性FSH刺激无反应的闭锁卵泡, 而已不分AMH的大卵泡会最先对Gn刺激产生反应, 所以将AMH结合AFC对卵巢反应性进行判断更加准确。国内学者大规模统计认为, AMH在预测ART中卵巢反应性方面与AFC重要性相当, 较年龄、基础FSH水平及基础E2水平更为准确,AMH≤1.19ng/mL或AFC≤9时卵巢反应性差(获卵数≤3), 而AMH≥4.17ng/mL或AFC>16时卵巢反应性好(获卵数>20)。目前临床上AMH在ART中的应用较为广泛, 甚至有望作为金标准以评价卵巢储备及预测卵巢反应性。
3.1 AMH在不同刺激方案中的预测价值
OI一般以诱导单卵泡或少数卵泡发育为目的。既往研究结果显示, OI第2日的血清AMH水平与获卵数密切相关, 而FSH、INHB和LH等激素则与获卵数无明显相关性。目前发现对克罗米芬(clomiphene citrate, CC)方案反应良好的PCOS患者血清AMH水平低于CC抵抗者, 因此AMH水平对PCOS患者治疗方案的选择有很大帮助, AMH切点值为7.77mg/L预测卵巢反应性良好的敏感性为65%,特异度为92% 。
COS应用对象多有正常排卵功能, 常用的Gn类药物分为天然Gn和基因重组Gn。天然Gn包括:从绝经妇女尿中提取的Gn, 如人绝经促性腺激素(hMG)、尿源性人卵泡刺激素(uFSH)和从孕妇尿中提取的人绒毛膜促性腺激素(uhCG)。基因重组Gn包括: rFSH、重组促黄体生成素(rLH)和重组hCG(rhCG)。IVF-ET中类似于300IU/drFSH固定剂量的一种长效FSH类似物Corifollitropin常常引起临床工作者担忧卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimulationsyndrome, OHSS)的发生, 但实验认为, AMH水平位于低限的患者使用该方案安全有效,AMH<0.42ng/mL者平均获卵数为2.7枚,而AMH水平位于1.4~2.1ng/mL者平均获卵数为6.3枚, 且AMH水平高者移植取消率也明显降低。
AMH在临床上为COS药物选择也有较大参考价值, 对于采用高纯度人绝经促性腺激素(HP-hMG)或rFSH促排卵的研究中观察到, AMH≥5.2ng/mL的患者相比, HP-hMG治疗组采用rFSH治疗组患者获卵数多, 卵巢高反应发生率高但活产率低。AMH对PCOS患者hMG微刺激方案卵巢低反应的预测价值较高, AMH水平位于切点值4.7ng/mL以下者卵巢反应性明显增高, 位于切点值以上者平均hMG剂量增加至1087IU, 用药时间延长至20d。基础血清AMH水平与雌激素、睾酮及雄烯二酮及采用HP-hMG或rFSH后长方案GnRH激动剂(GnRHagonist,GnRH-a)刺激的获卵数、FF中AMH水平及血清孕酮水平呈正相关。血清AMH水平可以预测刺激周期第6日Gn的剂量以及获卵过多(>15枚)或过少(≤7枚), 但并不能预示胚胎质量和妊娠率。
促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)根据其与受体的不同作用方式, 可分为GnRH-a及GnRH拮抗剂(GnRHantagonist, GnRH-A)。过高水平的AMH往往更准确地预示着ART中OHSS的发生, 不仅患者周期取消率增加, 严重的并发症有时甚至危及育龄期女性的生命。一项GnRH-a长方案研究中显示, OHSS患者平均卵巢卵泡数量23.7枚, 比对照组9.1枚明显增加, 获卵数13.5枚也明显高于对照组的6.9枚, AMH平均值为7.9ng/mL, 而对照组为3.6ng/mL, 且PCOS患者更容易发生OHSS。基础AMH水平和获卵数与OHSS的发生明显相关, 而仅AMH 与卵巢低反应(获卵数≤4枚)相关, 预测OHSS的最佳切点值为6.95ng/mL(AUC=0.86; 95%CI=0.78~0.95; 敏感性=75%; 特异度=84%), 而卵巢低反应最佳切点值为1.65ng/mL(AUC=0.8; 95%CI=0.69~0.91; 敏感性=89%; 特异度=71%)。香港一项采用GnRH-a长方案的大型研究表明, 当AMH 与AFC相吻合时预示着满意的获卵数和活产率, 而32.2%AMH与AFC不一致的患者卵巢反应差异度大, 相同AFC水平组AMH水平高者获卵率及活产率更高。
在采用GnRH-A方案的统计中观察到, AMH与获卵数明显相关, 在预测卵巢高反应及低反应方面较FSH、AFC或INHB有更大优势, 但AMH只能预测获卵数及囊胚数目, 无法预测卵泡质量。且对于GnRH-A方案, AMH预测卵巢反应性相比实际年龄和体质量指数(BMI)更加准确, 其中60%患者AMH≥4.5mg/L获卵数>15枚, 而45%AMH≤ 0.8mg/L者获卵数<4枚。采用GnRH-A短方案的PCOS患者AMH水平在FSH刺激开始时增加, 但随后降低至黄体中期再次复升,而对照组AMH水平在整个刺激周期均呈现降低趋势直至黄体中期, 但所有患者不论妊娠与否, 使用hCG后2周AMH均回归基线, 且PCOS患者AMH降低趋势提前可能与雄激素相关。部分学者表示, 在GnRH-a长方案和GnRH-A方案中, 在评价获卵数时, 血清AMH(AUC=0.882)作为一项独立因素能比实际年龄(AUC=0.816)更准确地预测卵巢高反应(>19枚)和低反应(≤4枚), 且准确性与AFC相当。
3.2 AMH与获卵数的关系
研究者实验认为, OHSS患者FF中AMH的浓度与E2及获卵数成反比, 明显低于对照组。尽管颗粒细胞(granulosacells, GCs)中无法检测到AMHmRNA, 但OHSS患者AMHRⅡ的mRNA水平显著低于对照组。通过下调AMHRⅡ构建的COS小鼠模型观察到敲除AMHRⅡ可增加卵巢对外源性Gn的反应导致OHSS的发生。血清AMH水平优于AMH和AMHRⅡ多态性, 与ART中OHSS与治疗结局密切相关, AMHRⅡ多态性与雌激素、AMH和FSH水平、胚胎数量及质量相关, 而AMH多态性只与胚胎数量相关。
对于接受COS及卵泡质内单精子注射-胚胎移植(intracytoplasmicsperminjection-embryotransfer,ICSI-ET)治疗的患者, AMH对卵巢低反应(poorovarianresponse, POR)同样具有预测价值, 因此AMH水平可为POR患者ART咨询提供有效帮助。POR是卵巢对Gn刺激反应不良的病理状态, 主要表现为卵巢刺激周期发育的卵泡少、血雌激素峰值低、Gn用量大、周期取消率高、获卵少和低临床妊娠率。随机血清AMH水平可以良好地预测POR患者卵巢的反应性, AMH≤1.2ng/mL者周期取消率高, 而AMH≥1ng/mL预测获得>4枚卵泡的几率较高, 且AMH≥1.5ng/mL者能取得较满意的临床妊娠率。周期取消率随AMH水平升高而下降, 尤其以FSH水平正常者为著, 其中AMH≤0.42ng/mL者卵巢反应性差, 妊娠率仅31%, 而AMH≥2.10ng/mL者卵巢反应性好, 妊娠率提高至35%。国外研究者认为,<35 岁AMH<1ng/mL的ART患者种植率仅为26%, 而对照组种植率为45%, 尤其AMH<0.47ng/mL的患者应该提前告知IVF-ET的高失败率。针对年龄<35岁ART的患者, 也有专家表明, 低水平AMH对临床妊娠率及活产率没有较大提示意义, 说明低水平AMH只代表卵泡数加速丧失, 早期卵巢开始衰老, 不代表已发生POF, 但AMH<2ng/mL者周期取消率仍明显升高。近期也有部分研究者认为, 在年龄≥36岁或明显发生卵巢储备低下的不孕患者中, AMH>0.4ng/mL者IVF/ICSI-ET活产率明显高于对照组。
3.3 AMH对ART结局的预测作用
已有学者证明IVF/ICSI中, 血清AMH水平能够反映获卵数、优质胚胎数和囊胚数, 而FF中AMH水平与活产率显著相关, FF的AMH预测临床妊娠率敏感性为91.2%, 特异度为86.5%, ROC(AUC)为0.893。目前研究推测, FF中AMH水平与获卵质量明显相关, FF中AMH水平低者受精率低于对照组。根据FF中AMH水平划分低、中、高3组, 33th百分位AMH2.1ng/mL, 67th百分位AMH3.6ng/mL,
AMH<2.1ng/mL者受精率为61.9%, 介于2.1ng/mL至3.6ng/mL者受精率95.5%, AMH>3.6ng/mL者受精率为77.3%。
一项接近900名女性的研究认为, 在同年龄及获卵数组, AMH水平与活产率成正比, 低于第25th百分位AMH<0.84ng/mL者活产率为10.7%, 而高于第75th百分位AMH>2.94ng/mL活产率为30.8%。有学者统计年龄≥35岁的IVF患者认为, 血清AMH是预测临床妊娠率的独立因素, 妊娠者AMH平均水平为3.20ng/mL, 显著高于妊娠结局失败者AMH平均水平(1.15ng/mL)。也有学者认为,AMH切点值1.0ng/mL可用于预测>40岁IVF患者POR(获卵数≤3枚)的发生, 以及能否接受胚胎移植治疗, 但对妊娠率的预测意义有限, 低AMH水平者仍可能获得满意的妊娠结局。有研究认为, 血清AMH水平对PCOS患者COS结局有较好的预测作用,hCG注射日血清AMH水平与雌激素和获卵数成正比, 与Gn剂量呈负相关, 且高水平AMH组受精率和优质胚胎数高于对照组。
总之, 血清AMH可代表卵巢中剩余原始卵泡的数量, 较为准确地反映窦卵泡池的大小。它不仅在一定程度上预测绝经年龄, 对于卵巢功能异常的PCOS、POF患者及手术和药物治疗后的患者卵巢功能恢复的评价均有一定帮助。接受ART的患者可通过AMH评估卵巢反应性, 调整治疗方案以预防并发症的发生,同时提高治疗成功率。经过更加深入的研究, AMH有望成为国际公认的卵巢储备评价指标, 并在ART临床工作中得到更广泛的应用。
